EXTRACCIÓN DEL ADN DE TEJIDOS VEGETALES: EXPERIMENTO CASERO
RESUMEN: La extracción del material genético, como es el caso del ADN, es una técnica que se realiza en laboratorios y centros de investigación para múltiples aplicaciones. Se realiza gracias a protocolos muy precisos donde se emplean métodos y materiales muy específicos, pero también se puede realizar protocolos menos preciso siendo caseros, con materiales que se pueden obtener de forma mas cotidiana.
(Las imágenes que a continuación se muestran son propias, salvo aquellas que se indican la fuente de donde se han obtenido)
INTRODUCCIÓN
La extracción de material genético se realiza para múltiples estudios genéticos, desde conocer el grado de parentesco entre especies, a detección de personas que padezcan una determinada enfermedad e incluso la creación de fármacos para curar múltiples enfermedades.
Este material genético se encuentra en casi toda las células que posee un organismo, por lo que para poder obtenerlo en primer lugar hay que sacarlo de esas células que lo tiene contenido en ellas. Pero antes de explicar como podemos obtener el material genético hay que preguntarse ¿Qué es el material genético?, ¿Cómo están formados? y ¿Cómo se estructuran?
1. Un monosacárido (una pentosa): La pentosa siempre es una aldopentosa, en el caso del ARN es una beta-D-ribofuranosa, y en este caso el nucleótido, se denomina ribonucleótido, mientras que en el ADN es una beta-D-2-desoxirribofuranosa, constituyente de los desoxirribonucleótidos.
2. Una base nitrogenada, puede ser de dos tipos:
- Púrica: derivada de la purina, siendo la Adenina (A) y la Guanina (G).
- Pirimidínica: derivada del anillo de pirimidina, siendo la Citocina (C), Timidina (T) y Uracilo (U).
3. Uno o varios grupos fosfatos.
Este material genético se encuentra en casi toda las células que posee un organismo, por lo que para poder obtenerlo en primer lugar hay que sacarlo de esas células que lo tiene contenido en ellas. Pero antes de explicar como podemos obtener el material genético hay que preguntarse ¿Qué es el material genético?, ¿Cómo están formados? y ¿Cómo se estructuran?
- ¿Qué es el Material Genético?
Todos los organismos poseen unas moléculas que dirigen y controlan la síntesis de sus proteínas, proporcionando la información que determina su especificidad y sus características biológicas. Estas moléculas, que reciben el nombre de ácidos nucleicos (ADN y ARN), contienen las instrucciones necesarias para realizar los procesos vitales y son las responsables de todas las funciones básicas de los seres vivos.
Lo que un individuo es, o podría llegar a ser, está determinado por sus ácidos nucleicos; esto son, por tanto, moléculas transmisibles a la descendencia. Incluso los virus, seres que están en la frontera entre lo vivo y lo inerte y que carecen de la mayor parte de las moléculas biológicas, tienen ácidos nucleicos responsables de sus características.
- Estructura de los Ácidos Nucleicos
1. Un monosacárido (una pentosa): La pentosa siempre es una aldopentosa, en el caso del ARN es una beta-D-ribofuranosa, y en este caso el nucleótido, se denomina ribonucleótido, mientras que en el ADN es una beta-D-2-desoxirribofuranosa, constituyente de los desoxirribonucleótidos.
2. Una base nitrogenada, puede ser de dos tipos:
- Púrica: derivada de la purina, siendo la Adenina (A) y la Guanina (G).
- Pirimidínica: derivada del anillo de pirimidina, siendo la Citocina (C), Timidina (T) y Uracilo (U).
3. Uno o varios grupos fosfatos.
Tanto la base nitrogenada como los grupos fosfatos se encuentran unidos a la pentosa.
Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son macromoléculas formadas por la unión de muchos monómeros denominados nucleótidos.
- Ácido Desoxirribonucleico (ADN o DNA)
El ADN está formado por la unión de
desoxirribonucleótidos, es decir, sus nucleótidos componentes contienen
desoxirribosa. Sus bases nitrogenadas pueden ser adenina, guanina, citosina y
timina, pero nunca uracilo.
La
molécula de ADN porta la información necesaria para el desarrollo de las
características biológicas de un individuo y contiene también los mensajes e
instrucciones para que las células puedan realizar sus funciones.
- Ácido Ribonucleico (ARN o RNA)
El ARN es un polímero no ramificado, compuesto por una
serie de nucleótidos unidos por enlaces éster fosfóricos. El ARN difiere del
ADN en que la pentosa de los nucleótidos constituyentes es la ribosa, y en que
entre las cuatro bases nitrogenadas aparece uracilo en lugar de timina.
Las
cadenas de ARN son más cortas que las de ADN y pueden aparecer tanto en el
núcleo como en el citoplasma celular.
El ARN
es la molécula encargada de sintetizar las proteínas específicas de un
organismo transmitiendo el mensaje genético codificado por el ADN. Este proceso
es muy complejo y requiere la intervención de varios tipos de ARN.
- Ácido Desoxirribonucleico (ADN o DNA)
El ADN está formado por la unión de
desoxirribonucleótidos, es decir, sus nucleótidos componentes contienen
desoxirribosa. Sus bases nitrogenadas pueden ser adenina, guanina, citosina y
timina, pero nunca uracilo.
El ADN
está constituido por dos cadenas polinucleotídicas unidas entre sí en toda su
longitud. Esta doble cadena puede disponerse en forma lineal (ADN del núcleo de
las células eucariotas) o en forma circula (ADN de procariotas, algunos virus…)
La
molécula de ADN porta la información necesaria para el desarrollo de las
características biológicas de un individuo y contiene también los mensajes e
instrucciones para que las células puedan realizar sus funciones.
- Ácido Ribonucleico (ARN o RNA)
El ARN es un polímero no ramificado, compuesto por una
serie de nucleótidos unidos por enlaces éster fosfóricos. El ARN difiere del
ADN en que la pentosa de los nucleótidos constituyentes es la ribosa, y en que
entre las cuatro bases nitrogenadas aparece uracilo en lugar de timina.
Las
cadenas de ARN son más cortas que las de ADN y pueden aparecer tanto en el
núcleo como en el citoplasma celular.
El ARN
es la molécula encargada de sintetizar las proteínas específicas de un
organismo transmitiendo el mensaje genético codificado por el ADN. Este proceso
es muy complejo y requiere la intervención de varios tipos de ARN.
MATERIAL Y MÉTODO
La extracción del ADN se puede realizar mediante una metodología casera o de laboratorio. Voy a describir ambos métodos a continuación.
- EXPERIMENTO CASERO 1 (PROTOCOLO CASERO)
- MATERIALES
- 4 g de sal de mesa (aproximadamente una cucharadita).
- 10 ml de detergente líquido (a su defecto champú).
- Enzimas digestivas (procedente de un zumo de piña)
- Enzimas digestivas (procedente de un zumo de piña)
- 10 ml de alcohol etílico (se puede emplear alcohol etílico 96º)
- Bolsa ZIP.
- Nevera.
- Colador o papel de filtro
- Vaso.
- Tubos de ensayo.
- Varilla fina.
- Propipeta y pipetas o en su caso jeringuilla.
- Mortero.
- Mortero.
- METODOLOGÍA
- Introducir las fresas troceadas en una bolsa de cierre ZIP y congelarlas.
- Una vez congeladas, sacarla del congelador y atemperarlas sin que lleguen a descongelarse completamente.
- Utilizar un mortero para triturarlas, pero no del todo.
- Volver a introducir el contenido en la bolsa con cierre ZIP.
- Anadir 5 g de sal, mezclar durante unos segundos.
- Añadir 10 ml de detergente líquido y medio vaso de zumo de piña.
- Homogeneizar el contenido en la bolsa durante 10 minutos, y terminar de triturar manualmente las fresas con ayuda de la bolsa (no meter la mano dentro de la bolsa hacerlo por fuera de ella).
- Trascurrido el tiempo, colocar papel de filtro sobre un vaso de precipitado.
- Verter, lentamente, el contenido de la bolsa en el papel de filtro para quedarnos con la fracción líquida de la mezcla.
- Una vez filtrado, coger una alícuota del vaso de precipitado y llevarlo a un tubo de ensayo, aproximadamente se llena 1/3 del mismo.
- A continuación, echar lentamente alcohol etílico 96° por la pared del tubo, la cantidad de alcohol será aproximadamente otro 1/3.
- Esperar unos minuto, y observar.
- Emplear la varilla para separar el ovillo de ADN.
- EXPERIMENTO CASERO 2 (PROTOCOLO CASERO)
- MATERIALES
- 120 ml de agua destilada (en su defecto agua mineral, en la medida de lo posible evitar el agua del grifo.
- 1,5 g de sal de mesa.
- 5 g de Bicarbonato sódico.
- 5 ml de detergente líquido (a su defecto champú).
- 10 ml de alcohol isoamílico a 0 ºC (se puede emplear alcohol etílico 96º)
- Batidora.
- Nevera.
- Colador o una centrífuga en caso de tenerla)
- Vaso.
- Tubos de ensayo.
- Varilla fina.
- METODOLOGÍA
- Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo triturado:
- 120 ml de agua.
- 1,5 g de sal.
- 5 g de bicarbonato sódico.
- 5 ml de detergente líquido.
2. Seleccionar el vegetal que se va a extraer el ADN, cortarlos a cuadrados y congelar.
3. Triturar la muestra con un poco de agua, en el caso de disponer de batidora
realizar impulsos de 10 s, con lo que muchas células se romperán y otras
estarán expuesta a la acción del detergente.
4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío, agitar virogorosamente durante al menos 2 minutos.
5. Separar los restos vegetales más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y pipetear el
sobrenadante.
6. Retirar 5 ml del caldo a un tubo de ensayo y añadir con una pipeta o jeringuilla
10 ml de alcohol enfriado a 0 ºC. Verterse lentamente el alcohol por la cara
interna del recipiente con el tubo de ensayo inclinado, quedando el alcohol
suspendido por encima del caldo molecular y el tampón.
7. Introducir la punta de la varilla estrecha hasta la interfase de alcohol con el caldo
molecular mas el tampón. Remover la varilla suavemente en espiral para ir
enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN.
8. Sacar la varilla con el ADN adherido.
- EXPERIMENTO EN LABORATORIO (PROTOCOLO CIENTÍFICO)
- METODOLOGÍA
- Recolectar 8 g de tejido foliar joven y fresco. Si debido a razones logísticas no se puede procesar el material el mismo día de la recolección, ni tampoco se cuenta con nitrógeno líquido o hielo seco para almacenarlo, se puede mantener humedecido a temperatura ambiente por no más de tres días. Sin embargo, el tejido foliar se puede almacenar a -80°C por tiempo indefinido.
- Pulverizar el tejido con nitrógeno líquido.
- Añadir 8 ml de solución de extracción. Dicha solución contiene: 150 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 15 mM de EDTA, pH 8,0; 1 M de cloruro de sodio; 1% (peso/volumen) de CTAB; 1% (peso/volumen) de PVP-3600 y 5% (volumen/volumen) de β-mercaptoetanol.
- Incubar a 65°C en baño María durante 30 min. Mezclar el tubo delicadamente cada 10 minutos. Este paso permite desnaturalizar (destruir) las enzimas y demás proteínas presentes en el tejido foliar pulverizado.
- Centrifugar a 2.000 x g, durante 15 min. Este paso remueve todos los residuos sólidos de la preparación.
- Transferir la fase acuosa superior (sobrenadante) a un tubo limpio y añadir medio volumen (4 ml) de fenol. Agitar suavemente. En este paso se siguen destruyendo las proteínas (debido a la presencia del fenol).
- Centrifugar a 2.000 x g, durante 20 min.
- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y añadir medio volumen (4 ml) de cloroformo: octanol.
- Incubar la mezcla con agitación, durante una hora, a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 2.000 x g, durante 20 min.
- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y añadir 1/10 del volumen (aprox. 0,8 ml) de acetato de sodio 3M, pH 5,2, frío (-20°C) y 6/10 del volumen (aprox. 5 ml) de isopropanol frío (-20°C).
- Incubar a -20°C durante dos días.
- Después de la incubación, centrifugar a 2.000xg, durante 30 min a temperatura ambiente.
- Desechar el líquido teniendo cuidado de no perturbar el botón de ADN que se forma al fondo del tubo.
- Añadir 2 ml de etanol al 70%. Esto ayuda a retirar las sales que se precipitaron junto con el ADN.
- Centrifugar a 2.000 xg, durante 3 min a temperatura ambiente.
- Dejar secar el botón de ADN a temperatura ambiente.
- Añadir 0,5 ml de agua destilada estéril y resuspender el botón de ADN agitando suavemente.
- Añadir 0,1 ml de una solución de ARNasa de 0,1 mg/ml. Incubar durante una hora a 37°C.
- Almacenar el ADN extraído a 4°C si se va a utilizar en menos de tres días. Alternativamente, el almacenamiento por largos períodos puede realizarse a -20°C.
RESULTADOS
El experimento que se ha llevado a cabo ha sido el Experimento Casero 1. Los resultados obtenidos ha sido un precipitado con forma de ovillo de lana, que es el material genético de las fresas, este material genético no solamente es ADN, sino ADN y ARN, ya que para poder obtener una muestra de ADN pura tendría que haberse empleado enzimas específicas para romper el ARN y eviten que se una al ADN.
DISCUSIÓN
La congelación, en este caso, de las fresas cortadas ayuda a la ruptura mecánica de las membranas celulares, ayudando a las enzimas del zumo de piña, para que se libere más fácilmente el material genético.
Mientras tanto el detergente sirve para realizar la separación de los lípidos (la grasa) de las proteínas que forman las membranas que rodean la célula y el núcleo.
Como se ha comentado anteriormente, el zumo de piña, al igual que el de papaya, posee una enzima denominada papaína, que provoca la eliminación de proteínas que puedan contaminar el ADN.
Una vez, que se ha realizado la liberación del material genético de las células, y se ha separado de las proteínas, todo queda disuelto en la solución que se ha preparado, así que para poder obtenerlo se necesita que precipite. Esto se consigue gracias al alcohol, ya que produce la separación del ADN de otros componentes celulares.
En este protocolo de Experimento Casero 1 que se ha seguido, no contempla el calentamiento de la muestra vegetal, pero sería recomendado realizarlo, ya que el calor suaviza los fosfolípidos de las membranas celulares y nucleares, además desactiva (desnaturaliza) a las enzimas DNAasas, que son las enzimas encargadas de cortar el ADN en trozos pequeños, lo que dificultaría observarlo. La temperatura adecuada sería los 60 ºC, ya que a esta temperatura se desnaturaliza las enzimas, pero no el ADN, ya que este se desnaturaliza a los 80 ºC.
CONCLUSIONES
La extracción del material es una metodología compleja que se realiza en multitud de laboratorios y centros de investigación, pero también estos complejos protocolos se pueden simplificar, y realizar una extracción de ADN no pura en casa o en centros docentes, con materiales que se pueden adquirir en cualquier tienda.
Este protocolo puede ser empleado para fines docentes en centros educativos, o en casa, para demostrar que el ADN no es algo etero o inaccesible que solamente lo pueden obtener los científicos en los laboratorios, o estudiarlo solamente en los libros de texto, sino que el material genético es algo real, tangible que realmente está ahí.
REFERENCIAS
- Alberts, B. et al. (2010). Biología Molecular de la célula. Ed. Omega. 5ª edición.
- Benítez, L.; Cebrián, A.;
Fernández, J. C.; Fumanal, M. y Gilabert, P. (2015). Desarrollo de
- De Robertis E. (2001). Biología celular y molecular. Ed. Ateneo. 15ª edición.
- Karp, G. (1998). Biología celular y molecular. McGraw-Hill/Interamerica.
- Rocha S., PJ (2002). Teoría y práctica para la extracción y purificación del ADN de palma de aceite. PALMA Vol. 3 No 3. Bogotá. Colombia.
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